水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定—液相色譜-串聯質譜法
Determination of the metabolites of Nitrofuran Antibiotics residues in aquatic products-LC-MS/MS method
水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定：液相色譜-串聯質譜法
1 範圍
本標準規定了水產品中呋喃它酮的代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡稱AMOZ，下同）、呋喃西林的代謝物氨基脲（簡稱SEM，下同）、呋喃妥因的代謝物1-氨基-2-內醯脲（簡稱AHD，下同）和呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-噁唑烷基酮（簡稱AOZ，下同）殘留量的液相色譜-串聯質譜的測定方法。
本標準適用於水產品中呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物殘留量的檢驗。
本標準規定呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物和呋喃唑酮代謝物的檢測限均為0.50 µg/kg。
2 規範性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協定的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本標準。
GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法
3 原理
樣品中殘留的硝基呋喃類抗生素代謝物在酸性條件下水解，用2-硝基苯甲醛衍生化，經固相萃取柱淨化後液相色譜-串聯質譜法測定，內標法定量。
4 試劑
除非另有說明，僅使用分析純試劑。
4.1 水：GB/T 6682規定的一級水。
4.2 甲醇：色譜純。
4.2.1 乙腈：色譜純。
4.2.2 乙酸乙酯：色譜純。
4.2.3 磷酸氫二鉀。
4.2.4 甲酸：優級純。
4.2.5 二甲亞碸：優級純。
4.2.6 鹽酸：優級純。
4.2.7 氫氧化鈉：優級純。
4.2.8 2-硝基苯甲醛（2-NBA）：純度 ≥ 99 %。
4.2.9 磷酸氫二鉀溶液：0.5 mol/L。稱取5.7 g磷酸氫二鉀（4.5）， 用水溶解，定容至50 mL。
4.2.10 鹽酸溶液：0.2 mol/L。量取17 mL濃鹽酸（4.8）用水定容至1 000 mL。
4.2.11 氫氧化鈉溶液：1 mol/L。稱取40 g氫氧化鈉(4.9)，用水溶解，定容至1 000 mL。
4.2.12 2-硝基苯甲醛溶液：8.0 g/L。稱取80 mg 2-硝基苯甲醛（4.10）溶於10 mL二甲亞碸(4.7)，臨用前配製。
4.2.13 Oasis HLB固相萃取柱或相當者：60 mg，3 mL。使用前分別用3 mL乙酸乙酯、3 mL甲醇和5 mL水預處理，保持柱體濕潤。
4.2.14 AMOZ、SEM、AHD、AOZ及同位素內標物AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3和SCA-13C-15N2標準物質：純度≥98 %。
4.2.15 標準儲備溶液：0.10 mg/mL。準確稱取四種硝基呋喃類代謝物標準物質及四種相應的同位素內標物，分別用甲醇配成0.10 mg/mL的標準貯備溶液。-18 ℃避光保存，保存期為三個月。
4.2.16 混合標準儲備溶液：1 µg/mL。吸取四種硝基呋喃類代謝物標準儲備溶液（4.17），用甲醇配成1 µg/mL。-18 ℃避光保存，保存期為三個月，使用前回溫到室溫。
4.2.17 混合內標工作溶液：100 ng/mL。吸取四種硝基呋喃類代謝物同位素的標準儲備溶液（4.17），用甲醇配成100 ng/mL。-18 ℃避光保存，保存期為三個月，使用前回溫到室溫。
4.2.18 混合標準工作溶液：根據需要，臨用前吸取一定量的混合標準儲備溶液（4.18），用甲醇稀釋配製適當濃度的混合標準工作液。
5 儀器和設備
5.1 液相色譜串聯四極杆質譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源。
5.2 恒溫振盪器。
5.3 固相萃取裝置。
5.4 高速臺式離心機：5 000 r/min。
5.5 氮氣吹幹儀。
5.6 pH計。
6 測定步驟
6.1 提取
稱取10 g均質試樣（精確到0.01 g）於50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL內標工作溶液（4.23），分別加入25 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液和0.5 mL衍生劑（4.14），渦旋混合1 min，置於37℃恒溫振盪器中保持16h。
6.2 淨化
將上述提取溶液（6.1）取出放置至室溫，加入1 mL 0.5 mol/L磷酸氫二鉀溶液（4.11），用1 mol/L 氫氧化鈉溶液（4.9）調節溶液pH範圍至7.0～7.4，以4 500 r/min的速度離心15 min，上清液過已Oasis HLB或相當的固相萃取柱（4.15），調節流速小於等於2 mL/min，待樣液全部通過固相萃取柱後用3 mL水洗固相萃取柱，棄去全部流出液。負壓下抽幹固相萃取柱10 min，再用6mL乙酸乙酯洗脫被測物，洗脫液全部收集於10 mL離心管中，並在氮氣吹幹儀上40℃水浴吹幹，1mL乙腈與0.4%甲酸水溶液（10+90）溶解殘渣，過0.2 μm濾膜，濾液供液相色譜-串聯質譜測定。
6.2.1 測定
6.2.1.1 色譜條件
a) 色譜柱：Zorbax XDB C18柱（150 mm×2.1 mm×5 μm）或相當者。
b) 柱溫：35℃。
c) 進樣量：40 mL。
d) 流動相及流速見表1。
6.2.1.2 質譜條件
a) 離子源：電噴霧離子源（ESI）。
b) 掃描方式：正離子掃描。
c) 檢測方式：多反應監測（MRM）。
d) 霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣；使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。
e) 噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度。
f) Q1，Q3均為單位解析度（UNIT）。
g) 定性離子對、定量離子對、採集時間（Dwell）見表2。
表1 液相色譜梯度洗脫條件
|
時間（min） |
流速（μL/min） |
0.4%甲酸水溶液（%） |
乙腈（%） |
|
0.00 |
200 |
70 |
30 |
|
3.00 |
200 |
70 |
30 |
|
3.01 |
250 |
25 |
75 |
|
8.00 |
250 |
25 |
75 |
|
8.01 |
200 |
70 |
30 |
|
15.00 |
200 |
70 |
30 |
表2 四種硝基呋喃代謝物的監測離子對
|
硝基呋喃代謝物名稱 |
定量離子對（m/z） |
定性離子對（m/z） |
採集時間（ms） |
|
AMOZ |
335/291 |
335/262 |
100；100 |
|
SEM |
209/166 |
209/192 |
100；100 |
|
AHD |
249/134 |
249/178 |
50；100 |
|
AOZ |
236/134 |
236/104 |
100；50 |
|
AOZ-D4 |
240/134 |
|
50 |
|
AMOZ-D5 |
340/296 |
|
100 |
|
AHD-D3 |
252/134 |
|
50 |
|
SCA-13C-15N2 |
212/195 |
|
100 |
6.3.3 液相色譜-串聯質譜測定
6.3.3.1 定性測定
在相同試驗條件下，樣品中待測物與同時檢測的標準物質具有相同的保留時間，並且非定量離子對與定量離子對色譜峰面積的比值相對偏差小於30%，則可判定為樣品中存在該殘留。
6.3.3.2 定量測定
按照6.3.1和6.3.2液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和混合標準工作溶液（6.1.4），以色譜峰面積按內標法定量，以AMOZ-D5 （m/z 340/296）計算AMOZ（m/z 335/291）的濃度，以SCA-13C-15N2（m/z 212/195）計算SEM（m/z 209/166）的濃度，以AHD-D3（m/z 252/134）計算AHD（m/z 249/134）的濃度，以AOZ-D4（m/z 240/134）計算AOZ（m/z 236/134）的濃度。 在上述色譜條件下標準溶液的提取離子流圖參見附錄A.1。
6.4 空白試驗
除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。
7 結果計算
測定結果可由電腦按內標法自動計算，也可按式（1）計算，計算結果需扣除空白值。
……（1）
式中：
X ─ 樣品中待測組分殘留量，單位為微克每千克（µg/kg）。
C ─ AMOZ、SEM、AHD或AOZ標準工作溶液的濃度，單位為微克每升（µg/L）。
Csi ─ 標準工作溶液中內標物的濃度，單位為微克每升（µg/L）。
C i0 ─ 樣液中內標物的濃度，單位為微克每升（µg/L）。
A00 ─ 樣液中AMOZ、SEM、AHD或AOZ的峰面積。
As ─ AMOZ、SEM、AHD或AOZ標準工作溶液的峰面積。
Asi ─ 標準工作溶液中內標物的峰面積。
Ai ─ 樣液中內標物的峰面積。
V ─ 樣品定容體積，單位為毫升（mL）。
W ─ 樣品稱樣量，單位為克（g）。
注：報告測定結果至小數二位。
8 方法檢測限、準確度和精密度
8.1 方法檢測限
本方法在水產品中AMOZ、AOZ、SEM和AHD的檢測限均為0.50 µg/kg。
8.2 準確度
本方法在0.50 µg/kg～10.0 µg/kg添加濃度的回收率均大於70 %。
8.3 精密度
本方法的相對標準偏差RSD小於15 %。
附錄A
（資料性附錄）
四種硝基呋喃類代謝物標準物質的提取離子流圖
A.1 AMOZ、AMOZ-D5、SEM、SCA-13C-15N2、AHD、AHD-D3、AOZ和AOZ-D4標準物質的提取離子流圖